テクニカルサポート（特許微生物寄託）
微生物の保存方法、アンプルの作製方法
微生物の保存方法やアンプルの作製方法を紹介します。
凍結法、凍結乾燥法の概略
微生物の保存法は多種ありますが、当センターでは生存率及び形質を維持する上で優れている3種類の保存法で寄託を受け付けております。以下にその概略を示します。
| 凍結保存法 *1) | 凍結乾燥法 | L-乾燥法 | |
|---|---|---|---|
| 保存方法の概要 | 細胞を凍結し代謝活動を停止させ、細胞を休止状態にすることで長期の生存を図る。 | 細胞内水分の大部分を占める水（自由水）を乾燥させて、代謝機能の場である液相を除いてこれを停止させ、細胞を休止状態にすることで長期生存を図る。 | |
| 昇華による固相からの乾燥 | 蒸発による液相からの乾燥 | ||
| 保存条件 | -80℃、又は液体窒素の気相中（-170℃付近）に保存 | 暗所にて低温（4℃前後）保存 | |
| 適用範囲 | 大多数の微生物 | 大多数の細菌・放線菌・胞子を形成するカビ・酵母・ファージで保存可能。ただし、凍結感受性の微生物においては、L-乾燥の方がより良い結果が得られる。 | |
| 特徴 | 長期保存性、株の安定性に優れる。 | 長期保存性、株の安定性に優れる。加速試験を行うことで長期保存性を予測することが可能である。 | |
| 生存に影響する因子 |
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| 一般的な保護剤とその組成 | 10～15%グリセリン または5～10%ジメチルスルホキシド(DMSO) | 10%スキムミルク ＋1%グルタミン酸ナトリウム | 3%グルタミン酸ナトリウム ＋0.1Mリン酸緩衝液 *2) |
| 図解 | 図1.凍結乾燥法 | 図2.L-乾燥法 | |
- *1) 凍結保存の一般的な方法として、液体培地等で定常期まで培養した微生物をなるべく 高濃度で回収（細菌の場合、10の9乗以上が望ましい）し、その菌体懸濁液に対してグリセロールを10～20% になるように添加し低温槽に保存します。ただし、保存性は微生物によって異なりますので、一本を試験的に解凍して生残性が十分であるかどうか確認してください。
- *2) 各保存方法あるいは、L-乾燥法で使用する保護剤（分散媒）については参考文献に詳しい情報がありますので当センターまでお問い合わせください。
- （参考文献）
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- L-乾燥法による微生物株の長期保存法. 坂根健、西井忠止、伊藤忠義、見方洪三郎
アンプルの先端について
アンプルの先端は必ずバーナーで炙って丸くしてください。偶発的な衝撃による破損等によって真空度低下や汚染の原因となります。
図3.アンプルの先端例
真空度について
アンプルの真空度が不良であると微生物の生存に悪影響を与えるため、アンプルの真空度が十分（約102Pa以下）であるか検査を行います。
図4.アンプルの真空度チェック
担子菌（キノコ）の凍結保存方法（Disk法、バーミキュライト法）
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Disk法
担子菌（キノコ）については凍結保存形態による寄託が可能です。これまでの研究によれば、-80℃での凍結保存によって830菌株の担子菌（キノコ）が少なくとも15年間長期保存できることがわかっています1),2)。 -
バーミキュライト法
担子菌の凍結保存法にはdisc凍結法が汎用的に用いられてきましたが、この方法では凍結保存が難しい種（主に菌根性担子菌）もありました。近年特許センターで行った研究開発の結果、従来法のdisc凍結法ではうまく保存出来なかったグループに対する有効な凍結保存法である“バーミキュライト法”を開発※しましたのでご紹介します（図5、図6）。詳しくはNBRCニュース3)またはDBRP4)、参考文献5)をご覧ください。
図5．担子菌培養株凍結保存方法の開発工程
（図をクリックすると拡大図がPDFで開きます。）
図６．バーミキュライト法について
（図をクリックすると拡大図がPDFで開きます。）- （参考文献）
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- １．キノコ（担子菌類）の長期保存法：伊藤忠義 日本菌学会西日本支部会報 第10号 23-25,2000
- ２．Viability of frozen cultures of Basidiomycetes after fifteen-year storage. Microbiol. Cult. Coll. 12: 67-78
- ３．NBRCニュース 第６６号,微生物の保存法（20）バーミキュライト法による担子菌類の凍結保存法
- ４．DBRP； バーミキュライト法による菌根性担子菌培養株の凍結保存法の開発
- ５．Vermiculite as a culture substrate greatly improves the viability of frozen cultures of ectomycorrhizal basidiomycetes. Fungal Biology. 124, 742-751
※ 本研究開発は、特許庁委託事業 「特許微生物寄託等業務」の一環で実施されたものです。
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お問い合わせ
- 独立行政法人製品評価技術基盤機構 バイオテクノロジーセンター 特許微生物寄託センター(NPMD)
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TEL：0438-20-5580
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