NBRCニュース　第８５号

   細菌では、カロテノイドの一種であるゼアキサンチンを産生するMuricauda属細菌（NBRC 115792, 115793）を公開しました。藻類では、建物の屋外コンクリートデッキの塗装表面から単離されたInterfilum sp. (class: Ulvophyceae) NBRC 113306を公開しました。また、細胞外多糖類（EPS）を産生するシアノバクテリア3株（NBRC 115796～115798）を公開しました。

【新たに提供を開始した微生物資源】
https://www.nite.go.jp/nbrc/cultures/nbrc/new_strain/new_dna.html

   この度、Bifidobacterium psychraerophilum Yasuke株（=NBRC 116469）とLactiplantibacillus plantarum kamigare株（=NBRC 116468）をNBRCに寄託しましたので、両株をご紹介させていただきます。

   B. psychraerophilum Yasuke株は、「紀州なれ寿司」から分離されたビフィズス菌で、日本の伝統的発酵食品からビフィズス菌が分離されたのは初めてであると考えています。紀州なれ寿司は日本三大なれ寿司の一つといわれ、約800年以上の歴史があります。紀州なれ寿司は、サバを開き、１ヶ月以上塩漬けにした後、一晩水で塩を抜き、これを飯にのせ、ダンチクの葉で巻き、樽に詰めて重石をして発酵させます。発酵日数は１～２週間前後が一般的です。

   我々は、明治時代を創業とし、なれ寿司を生産している和歌山市の「弥助寿司」から、製造の季節や発酵日数の異なる12本のなれ寿司を入手し、次世代シーケンサーを用いて菌叢解析を行いました。その結果、乳酸菌の発酵への貢献が確認されましたが、特定の属が優占となることはなく、発酵に関与する乳酸菌の多様性を確認しました(1)。その際、菌叢をよく観察すると、比較的発酵が進んだなれ寿司の菌叢にビフィズス菌の混在が観察されることがありました。

   そこで、ビフィズス菌の分離を試みることにしました。先ず、ビフィズス菌が本当に存在することを確認するために、菌叢解析により混在が示唆された試料を用いて、ビフィズス菌を特異的に検出可能なプライマー（g-Bifid-Fとg-Bifid-R）を用いて特定の遺伝子の増幅を行い、比較的きれいな一本のバンドを得ました。これらの塩基配列を調べたところ、全ての試料の配列が同じであり、Bifidobacterium aquikeferi またはB. psychraerophilum であると推定されました。当研究室ではビフィズス菌を取り扱っていましたが分離の経験は無かったため、簡単に分離することはできませんでした。「弥助寿司」から、なれ寿司を何度か入手し、最終的には令和５年１月に入手した試料から分離することができました。分離したビフィズス菌は16S rRNAとhsp60遺伝子の相同性からB. psychraerophilumであると同定されました。また、次世代シーケンサーによるドラフトゲノム解析の結果からも同定が正しいことを確認し、本分離株をYasuke株と名付けました。

   Yasuke株の耐酸性、耐酸素性、耐塩性をB. psychraerophilum、Bifidobacterium longum、 Bifidobacterium adolescentisそれぞれの基準株と比較したところ、Yasuke株は耐塩性と耐酸素性に優れていることが示唆されました。即ち、耐酸性は同程度であること、耐酸素性はB. psychraerophilum の基準株とは同程度だが他の2種よりは顕著に高いこと、耐塩性はB. psychraerophilum の基準株よりもやや高くまた他の2種と比べると明らかに高いことを確認しました。Yasuke株の起源については推測の域を出ませんが、「弥助寿司」に住み着いているのではと考えています。どの試料から遺伝子を取得しても同じ配列になり、耐塩性と耐酸素性もあることから、なれ寿司の生産環境に適していると考えられるからです。また、発酵の主役となる乳酸菌はサバを起源とすると推定され、多様性があるのに対し、ビフィズス菌には多様性がないからです。サバを起源とするのなら多様性があると考えられます。

   ビフィズス菌といえば乳製品です。そこで、Yasuke株を用いてヨーグルトとチーズの作製に挑戦しました。市販の牛乳にYasuke株を添加し、市販のヨーグルトメーカを用いて発酵させたところ、牛乳が固化しpH4.0程度まで酸度が低下していました。当研究室に保存されているB. longum、B. adolescentis、Bifidobacterium lactisと比較しましたが、ここまで酸度を下げることのできるビフィズス菌はありませんでした。そのため、できあがったヨーグルトはかなり酸っぱく、これはYasuke株が酢酸を産生しているためと考えられます。チーズもヨーグルトメーカを用いてレンネットを添加することで作製を試みたところ、モッツァレラチーズ様のチーズができました。こちらはヨーグルトのような酸っぱさがなく、おいしいチーズになりました。ヨーグルトメーカで簡単にヨーグルトやチーズができたのは、Yasuke株が持つ耐酸素性に起因していると考えられ、扱いやすいビフィズス菌であると言えます。

   Lactiplantibacillus plantarum kamigare株は、岐阜県の上ヶ流地区で後発酵茶を生産するために分離した乳酸菌です。後発酵茶とは、紅茶やウーロン茶のように酵素発酵させた茶ではなく、微生物発酵させた茶のことです。日本では、石鎚黒茶、阿波晩茶、碁石茶、バタバタ茶が知られています。玉露と同程度の価格で流通しており、付加価値の高いお茶として生産されています。石鎚黒茶と阿波晩茶の菌叢を解析したところ、Lactiplantibacillus属の乳酸菌が中心となって発酵していることが分かりました(2)。

   一方で、岐阜県の上ヶ流地区には茶畑が広がっており、無農薬で生産されています。一番茶は出荷されますが、番茶は廃棄されるか乾燥番茶として安価に売られています。そこで、この乾燥番茶を上ヶ流地区から分離した乳酸菌を使って発酵させ、付加価値の高い後発酵茶を生産しようと考えました。上ヶ流地区の野草からLactiplantibacillus属の乳酸菌を分離し、その中から、後発酵茶に用いられる乳酸菌に特徴的な、殺菌ペプチドであるバクテリオシン遺伝子を持つ株を選択しました(3)。これが、上ヶ流地区のタンポポから分離されたL. plantarum kamigare株になります。kamigare株を用いると茶葉を嫌気条件にすることで後発酵茶を作ることが可能です。

【文献】
(1) Kubo et al. (2022). Biosci. Biotechnol. Biochem. 86 (12): 1705-1717
(2) Horie et al. (2023). Fermentation 9 (10): 876
(3) 刘 子路ら (2022). 美味技術学会誌 21 (1): 6-11

   NBRCでは、「独立行政法人の事務・事業の見直しの基本方針（平成22年12月7日閣議決定）※」に基づき受益と負担の適正化を考慮し、実費を勘案した手数料を利用者の皆様にご負担いただいております。この度、直近の実費に基づき見直しを行い、2024年4月1日から手数料を改定させていただくことになりましたのでお知らせいたします。

   新しい手数料額の詳細は、こちらをご確認ください。今後もサービスの継続とさらなる品質向上に努めてまいりますので、何卒ご理解を賜りますようお願い申し上げます。

【2024年4月1日から手数料を改定する業務（証明書の発行等関連する業務を含みます）】
・NBRC株の分譲
・RD株の提供
・DNAリソースの分譲
・生物遺伝資源バックアップサービス
・NBRC微生物カクテルの提供
・継続保管

【手数料改定のお知らせ】 https://www.nite.go.jp/nbrc/cultures/information/amendment_of_fee_FY2023.html

※「独立行政法人の事務・事業の見直しの基本方針（平成22年12月7日閣議決定）」において、「特定の者が検査料、授業料、利用料、配布価格、技術指導料等を負担して実施する事業については、受益者の負担を適正なものとする観点から、その負担の考え方を整理し、これに基づき、国民生活への影響に配慮しつつ検査料等の見直しを行う。」とされております。